基于機器學習翻譯，僅供參考。

練習2：查找CRISPR位點并檢查脫靶匹配度

除了感興趣的基因之外，gRNA序列可以結(jié)合基因組中的其他區(qū)域。Cas9也會影響這些基因組區(qū)域的序列。根據(jù)這些其他結(jié)合位點的位置，這可能會產(chǎn)生嚴重的意外后果。當選擇CRISPR位點時，我們通常感興趣的是基因組中g(shù)RNA序列可能與多少個其他位置結(jié)合以及這可能具有什么影響。Geneious中的Find CRISPR位點工具可以搜索非目標綁定，并使用此信息為每個CRISPR位點計算得分。

在第一個練習中，您使用Find CRISPR位點功能查找LYP1 CDS中的所有“GN（20）GG”位點。在本練習中，您還將檢查異常與釀酒酵母基因組的結(jié)合情況。

要做到這一點，首先需要創(chuàng)建一個您希望針對脫靶結(jié)合位點進行測試的序列數(shù)據(jù)庫 - 這通常是您感興趣生物組織的整個基因組，但可以包含其他序列，例如靶向向量。要制作數(shù)據(jù)庫，請在Geneious中創(chuàng)建一個新的空文件夾，然后將要測試的序列導入到該文件夾??中。由于研究人員可能希望測試的基因組種類繁多，基因組序列可能非常大，并且可能會發(fā)布新版本的基因組組合，Geneious不包含任何全基因組序列的內(nèi)置拷貝。可以使用NCBI直接從NCBI下載基因組位于Geneious的Sources面板底部的文件夾（這是Geneious左側(cè)的面板）。常用研究的基因組（例如，人類，斑馬魚和大鼠基因組）可以從NCBI中下載，使用Geniouss文件夾中的Geneomes文件夾中的鏈接。基因組也可以從其他來源下載并使用通用文件格式導入Geneious。

在本教程中，已經(jīng)為您創(chuàng)建了脫靶序列的數(shù)據(jù)庫。由于本教程確定了釀酒酵母?LYP1基因中的CRISPR位點，我們對釀酒酵母基因組中的脫靶結(jié)合感興趣?。釀酒酵母的完整基因組已從NCBI下載并置于酵母基因組文件夾中。要查看這些序列，請打開此文件夾。

要運行Find CRISPR位點工具來識別CRISPR位點并檢查脫靶綁定，請選擇LYP1 CDS文檔（geneious的demo數(shù)據(jù)，網(wǎng)上提供下載）并轉(zhuǎn)到克隆→查找CRISPR位點。

在Binding位點旁邊，依次選擇Anywhere。在目標類型“GN（19）”?旁邊的字段以及PAM Site字段中鍵入“NGG”。通過檢查目標活動保留分數(shù)位點。

現(xiàn)在通過脫靶分析和分數(shù)數(shù)據(jù)庫來評分分數(shù)位點。然后選擇包含我們想測試的序列的文件夾以進行非目標結(jié)合：點擊選擇一個文件夾并選擇“酵母基因組”文件夾。對于速度和過濾策略，請選擇慢速 - 對所有位點進行評分。將最大不匹配設(shè)置保留為缺省值3，以便與脫離目標不匹配，并允許0為indels。

注意：如果我們沒有選擇Score作為脫離目標數(shù)據(jù)庫，但選擇在較大序列的選定子區(qū)域內(nèi)查找位點，Geneious將自動測試序列的未選定區(qū)域以進行脫靶結(jié)合。

這一次，我們希望以偏離目標分數(shù)為結(jié)果軌跡著色，因此請確保此選項在Color CRISPR sites by設(shè)置。對話框現(xiàn)在應該如下圖所示。點擊確定運行搜索。

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CRISPR位點查找工具運行后，您將看到以下消息：

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此消息出現(xiàn)是因為我們在LYP1 CDS中搜索CRISPR位點的序列也存在于脫靶數(shù)據(jù)庫中，因為它是酵母基因組的一部分。由于它們很可能成為本身，因此該區(qū)域內(nèi)的匹配被忽略，因為它們可能是向?qū)稽cguide site本身。

與之前的練習一樣，Geneious在LYP1序列中注釋了41個“GN（20）GG”CRISPR位點，并將它們歸入CRISPR Sites。

序列中的每個CRISPR位點已根據(jù)其可能結(jié)合的脫靶位點數(shù)量以及脫靶位點與原序列的相似程度進行評分。“非目標分數(shù)”是根據(jù)麻省理工學院張峰實驗室開發(fā)的方法計算出來的（欲了解更多信息，請點擊這里）。根據(jù)每個脫離目標位點與原始CRISPR位點的相似程度以及發(fā)生何種不匹配（PAM位點附近的不匹配將比距離PAM位點更遠的不匹配更多地影響綁定）給出評分。脫靶位點的較高分數(shù)表明與原始CRISPR位點更高的相似性（并且因此CRISPR / Cas復合物與脫靶標結(jié)合的可能性更高）。CRISPR位點的總分是100％減去目標基因組中偏離分數(shù)的加權(quán)總和。因此，更高的分數(shù)表示更好的CRISPR位點，而潛在的異地目標很少或很弱。

序列中的CRISPR注釋現(xiàn)在根據(jù)其CRISPR分數(shù)進行著色。此配色方案使用紅色到綠色的漸變色，CRISPR分數(shù)為20％時注釋為純紅色，85％為純黃色，100％時為純綠色。

單擊保存按鈕將注釋軌道保存在序列中。

打開注解選項卡。要僅顯示注釋表中的CRISPR注釋，請單擊“?類型”并選擇“?CRISPR”。單擊列并勾選脫離目標分數(shù)和＃脫離目標位點（這些可能已被選中）。這些列現(xiàn)在應該在注釋表中可見。

單擊注釋表中列的名稱將按該列中的值對表中的行進行排序。列名旁邊將出現(xiàn)一個小三角形，指示行是從最小值到最大值進行排序，反之亦然。再次單擊列名將顛倒行排序的方向。按照最低到最高的脫靶評分對注釋表的行進行排序。

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從這張表中你可以看到許多CRISPR位點的偏離目標得分為100％，這意味著它們沒有脫離匹配的匹配符合無插入的條件和3個或更少的與gRNA錯配（但是它們可能有額外的3個以上不匹配的脫靶點）。CRISPR guide 41具有最低的脫靶評分。在表格中選擇此行并返回序列視圖。現(xiàn)在應該在序列視圖中選擇“CRISPR guide 41”注釋。將鼠標懸停在注釋上，出現(xiàn)一個黃色的工具提示。此工具提示包含有關(guān)此CRISPR位點的更多信息。

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該位點的CRISPR得分為83.33％。釀酒酵母基因組中只有一個此脫序結(jié)合位點，但它與CRISPR guide完全匹配，所以脫靶評分為100％。該位點位于136,903位的ALP1 CDS→14號染色體的136,925位。

對于具有多個脫離目標位點的CRISPR guide，只有前五位將列在工具提示中。此信息也可以從“?注釋”選項卡查看，排序和導出。

要從序列中刪除這些注釋，請單擊序列視圖中條目名稱左側(cè)的箭頭，然后選擇刪除條目并單擊保存按鈕。

未完，繼續(xù)[4]