使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位點與脫靶結合位點[2]

基于機器學習翻譯，僅供參考

練習1：查找CRISPR位點

在本練習中，您將運行Find CRISPR位點功能來查找LYP1 CDS序列上的“GN（20）GG”CRISPR網站。

選擇LYP1 CDS（這個文件是geneious專用的demo數據格式，當您下載了geneious可以導入進去使用，或者導入您感興趣領域的數據）文檔，然后轉到克隆→查找CRISPR位點。

首先，將選項重置為默認設置。要做到這一點，點擊窗口左下角的齒輪，并選擇重置為默認值（如果當前設置為默認設置，這將變為灰色）。

由于我們想要在此序列中的任意位置查找CRISPR位點，因此在綁定位點旁依次選擇無處不在。

在Motif面板中，使用Target和PAM字段指定要搜索的gRNA序列。如果您希望評估所有潛在的CRISPR位點，請在目標框中輸入N（20）。或者，如果您想要檢查異地綁定的特定序列，則可以在目標框中輸入確切的序列。在本教程中，我們對“GN（20）GG”指南序列感興趣。目標序列為GN（19），PAM序列為NGG，因此目標字段類型為“GN（19）”，PAM Site字段類型為“NGG”。這些字段下方的預覽顯示了該目標和PAM序列的指導序列 - 即GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG

在本練習中，我們只關注“GN（20）GG”位點在序列中的位置，因此取消選中通過脫靶分析對位點進行評分的選項。我們要評估每個位點的活動，因此請通過檢查目標活動來保持分數網站。對話框現在應該如下圖所示。點擊確定運行搜索。

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Geneious將使用“GN（20）GG”基序鑒定該序列上的任何CRISPR位點并對其進行注釋。“查找CRISPR位點”功能每次運行的注釋都被分組到一個標有CRISPR位點的新軌道中。CDS中有41個“GN（20）GG”CRISPR位點。

將鼠標懸停在其中一個網站上，您將看到一個彈出式窗口，其中包含有關該網站的信息。該信息包括On-target活動評分，其是在該位點的gRNA結合和Cas9切割效率的量度，如在Doench等2014中所計算的。此分數是介于0和1之間的數字，數字越高表示預期活動越高。CRISPR位點注釋根據此分數自動著色，從綠色（高分）到黃色和紅色（差分）的漸變。

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要從序列中刪除這些注釋，請單擊序列視圖中曲目名稱左側的箭頭，然后選擇刪除曲目。

未完，繼續第三[3]部分