D-熒光素鉀鹽-小動(dòng)物活體成像技術(shù)核心金標(biāo)準(zhǔn)試劑

D-熒光素是一種在生物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)物質(zhì)，可產(chǎn)生生物發(fā)光。當(dāng)熒光素在螢火蟲(chóng)熒光素酶和ATP的催化作用下被氧化時(shí)，產(chǎn)生光。熒光素能夠穿透細(xì)胞膜并且可以用于監(jiān)測(cè)已被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)熒光素酶的體內(nèi)感興趣細(xì)胞的活性。因?yàn)榕c熒光素酶的反應(yīng)是ATP依賴性的，所以也可以確定細(xì)胞活性。

d熒光素生物發(fā)光底物已經(jīng)在許多的被驗(yàn)證體內(nèi)使用PerkinElmer的IVIS生物光子成像應(yīng)用?成像系統(tǒng)。

Molecular Information: C11H7KN2O3S2 (MW: 318.4) 

規(guī)格

一、生成模型中熒光素酶活性的動(dòng)力學(xué)曲線 

1.通過(guò)腹膜內(nèi)（i.p.）途徑用15mg / ml或30mg / ml的溶液將熒光素注射入動(dòng)物體內(nèi)， 溶于PBS，工作劑量為150 mg / kg。*

2.等待三分鐘，用你選擇的方法鎮(zhèn)靜動(dòng)物;氣體或注射麻醉。 （2％ 異氟醚氣體麻醉可使健康動(dòng)物在IVIS中安全鎮(zhèn)靜45分鐘。）

3.將鎮(zhèn)靜的動(dòng)物放入成像室并拍攝第一張圖像，現(xiàn)在大約為5張 在Luciferin注射后幾分鐘。

4.每隔5-10分鐘繼續(xù)拍攝圖像，最多約40分鐘。這將表明動(dòng)力學(xué) 模型中熒光素?cái)z取的曲線。

5.一旦建立了曲線，就可以按照右側(cè)的成像程序進(jìn)行操作 此后成像的最佳時(shí)間點(diǎn)。 （Luciferin注射后10-20分鐘對(duì)大多數(shù)人來(lái)說(shuō)是理想的 楷模。）

6.每隔10分鐘，最多40分鐘，使用IVIS成像系統(tǒng)檢查體外生物發(fā)光 確定動(dòng)力學(xué)曲線并找出每種細(xì)胞類型的峰值成像時(shí)間點(diǎn)。

二、使用PerkinElmerIVIS?體內(nèi)成像系統(tǒng) 

1.將熒光素注入動(dòng)物體內(nèi)。用15mg / ml或30mg / ml的溶液溶解在PBS中，進(jìn)行加工劑量為150毫克/千克。*

2.根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線確定允許在動(dòng)物中分配最佳時(shí)間。

3.將鼠放入透明的有機(jī)玻璃麻醉盒（2.5-3.5％異氟醚）中，使視覺(jué)暢通無(wú)阻監(jiān)測(cè)動(dòng)物;例如人們可以很容易地確定動(dòng)物是否在呼吸。 向盒子提供麻醉的管子被分開(kāi)，以便麻醉的濃度相同輸送到位于成像室內(nèi)的麻醉歧管。

4.一旦麻醉完全發(fā)揮作用，將鼠從盒子轉(zhuǎn)移到附著的鼻錐上成像室內(nèi)的歧管。關(guān)上門然后點(diǎn)擊Living中的“獲取”按鈕計(jì)算機(jī)屏幕上的圖像程序。成像時(shí)間為每個(gè)位置1至5分鐘（背/腹），取決于實(shí)驗(yàn)，每個(gè)位置的5分鐘數(shù)是最大值。當(dāng)將鼠從背部轉(zhuǎn)向腹部（反之亦然）時(shí)，可以檢查它是否有任何窘迫的跡象或生命力的變化。成像過(guò)程完成后，將鼠放回籠中，快速喚醒。

*注意：許多人喜歡注入清醒的動(dòng)物。注射前鎮(zhèn)靜鼠是可以接受的，但是這樣做可能會(huì)略微延長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)（峰值熒光素酶表達(dá)時(shí)間）。

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備和執(zhí)行步驟

實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

?D-Luciferin螢光素鉀鹽，1.0克/瓶（PerkinElmer訂貨＃122799）

?無(wú)菌水

?完整的媒介

應(yīng)將細(xì)胞接種于平板中過(guò)夜或測(cè)定前數(shù)小時(shí)，以使細(xì)胞附著于細(xì)胞 底部。可以將懸浮細(xì)胞系接種在平板中的工作溶液中以進(jìn)行直接培養(yǎng)成像。

如果倍增時(shí)間相對(duì)較短，則應(yīng)考慮倍增時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

執(zhí)行步驟

1.在無(wú)菌水中制備200X熒光素儲(chǔ)備液（30 mg / ml）。注意：人們可以重建 將全部1.0克D-熒光素在33.3毫升無(wú)菌水中制成30毫克/毫升（200倍）的原液，或重建個(gè)體實(shí)驗(yàn)所需的D-熒光素的量。

2.通過(guò)倒置輕輕混合，直至熒光素完全溶解。*

3.在預(yù)熱的組織培養(yǎng)基中制備150μg/ ml的D-熒光素工作溶液。 快速解凍200X熒光素的儲(chǔ)備溶液，并在完全培養(yǎng)基中稀釋1：200（最終150μg/ ml）濃度）。

4.從培養(yǎng)的細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基。

5.在成像前將1x熒光素溶液加入細(xì)胞中。注意：將細(xì)胞在37°C下短時(shí)間孵育在成像之前可以增加信號(hào)。孵育時(shí)間取決于特定的細(xì)胞類型。一般來(lái)說(shuō)孵育10分鐘就足夠了;根據(jù)需要進(jìn)行測(cè)試和調(diào)整。

6.每隔10分鐘，最多40分鐘，使用IVIS成像系統(tǒng)檢查體外生物發(fā)光確定動(dòng)力學(xué)曲線并找出每種細(xì)胞類型的峰值成像時(shí)間點(diǎn)。

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備和執(zhí)行步驟

實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

?D-Luciferin，螢火蟲(chóng)，鉀鹽，1.0克/瓶（PerkinElmer訂貨＃122799）

?DPBS，不含Mg2 +和Ca2 +

?注射器過(guò)濾器，0.2μm

執(zhí)行步驟

1.在DPBS中制備15mg / ml新鮮的Luciferin原液。*

2.通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾滅菌。

3.確定10μL/ g體重的注射量。每只小鼠應(yīng)接受150毫克熒光素/千克 體重。 （例如，對(duì)于10g小鼠，注射100μL以遞送1.5mg熒光素）

4.在體內(nèi)成像前10-15分鐘腹膜內(nèi)（i.p.）注射熒光素，或由 動(dòng)力學(xué)曲線。**

*強(qiáng)烈建議在稀釋后立即使用工作溶液。必要時(shí)溶解螢光素 可在4°C下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)3周;但是，在4°C或-20°C下長(zhǎng)時(shí)間存放可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)退化。

**應(yīng)對(duì)每個(gè)新動(dòng)物模型進(jìn)行熒光素動(dòng)力學(xué)曲線以確定峰值信號(hào)時(shí)間。

請(qǐng)參閱我們的'確定您的模型的熒光素動(dòng)力學(xué)曲線'說(shuō)明書(shū) 在我們的網(wǎng)站上下載。

注意：熒光素是一種光敏試劑，應(yīng)盡可能避免直射光。我們 建議保護(hù)熒光素免受光照（例如用光阻材料如錫覆蓋）

在整個(gè)測(cè)定過(guò)程中，從原液制備到程序完成。