使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位點與脫靶結(jié)合位點[5]

基于機器學(xué)習(xí)翻譯，僅供參考。

練習(xí)4：找到配對的CRISPR位點

一種提高CRISPR / Cas9靶向特異性的方法是使用突變體Cas9-D10A切口酶以及與靶位點的相對鏈互補的一對引導(dǎo)RNA。相反鏈上的兩個單獨切口模擬雙鏈斷裂，然后導(dǎo)致非同源末端連接。脫靶相互作用被最小化，因為任何單個脫靶切口將通過堿基切除修復(fù)途徑以更高的保真度被修復(fù)。

在本練習(xí)中，您將使用Find CRISPR Sites在LYP1 CDS上查找配對位點。選擇LYP1 CDS文檔（geneious的demo數(shù)據(jù)文件，可以下載）并轉(zhuǎn)到克隆→查找CRISPR位點。

和前面的練習(xí)保持相同的設(shè)置，除了設(shè)置速度和過濾策略上慢-評分所有的位點，因為我們想進行評分所有位點的這項工作。

要找到配對的CRISPR位點，請勾選Pair CRISPR sites旁邊的復(fù)選框。您可以指定返回位點的最大允許重疊，以及配對位點之間允許的最大空間。位點之間的最大重疊和最大空間從CRISPR位點的5'，PAM遠端測量。我們將分別使用默認(rèn)選項6和16。

對話框現(xiàn)在應(yīng)該如下圖所示。點擊確定運行搜索。

Geneious已經(jīng)注釋了三對CRISPR位點。

當(dāng)使用Pair CRISPR位點選項時，Geneious將只注釋至少有一對位點給定位點設(shè)置之間的最大重疊和最大空間。在這些設(shè)置中沒有配對的位點沒有注釋。

每對CRISPR位點都有一個“配對的CRISPR評分”。如果您將鼠標(biāo)放在其中一個CRISPR注釋上，則可以查看該位點的配對CRISPR分?jǐn)?shù)。這個綜合分?jǐn)?shù)是兩個CRISPR分?jǐn)?shù)的平均值。具有最高綜合得分的CRISPR位點對相關(guān)聯(lián)。每個CRISPR位點都將鏈接到其得分最高的配對位點，除非該第二個位點與另一個位點的得分更高。這對位點根據(jù)他們的配對分?jǐn)?shù)進行著色，而不是他們各自的CRISPR分?jǐn)?shù)。

恭喜，你現(xiàn)在已經(jīng)完成了CRISPR教程。完結(jié)。