基于機(jī)器學(xué)習(xí)翻譯，僅供參考。

練習(xí)2：查找CRISPR位點(diǎn)并檢查脫靶匹配度

除了感興趣的基因之外，gRNA序列可以結(jié)合基因組中的其他區(qū)域。Cas9也會(huì)影響這些基因組區(qū)域的序列。根據(jù)這些其他結(jié)合位點(diǎn)的位置，這可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的意外后果。當(dāng)選擇CRISPR位點(diǎn)時(shí)，我們通常感興趣的是基因組中g(shù)RNA序列可能與多少個(gè)其他位置結(jié)合以及這可能具有什么影響。Geneious中的Find CRISPR位點(diǎn)工具可以搜索非目標(biāo)綁定，并使用此信息為每個(gè)CRISPR位點(diǎn)計(jì)算得分。

在第一個(gè)練習(xí)中，您使用Find CRISPR位點(diǎn)功能查找LYP1 CDS中的所有“GN（20）GG”位點(diǎn)。在本練習(xí)中，您還將檢查異常與釀酒酵母基因組的結(jié)合情況。

要做到這一點(diǎn)，首先需要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)您希望針對(duì)脫靶結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試的序列數(shù)據(jù)庫(kù) - 這通常是您感興趣生物組織的整個(gè)基因組，但可以包含其他序列，例如靶向向量。要制作數(shù)據(jù)庫(kù)，請(qǐng)?jiān)贕eneious中創(chuàng)建一個(gè)新的空文件夾，然后將要測(cè)試的序列導(dǎo)入到該文件夾??中。由于研究人員可能希望測(cè)試的基因組種類(lèi)繁多，基因組序列可能非常大，并且可能會(huì)發(fā)布新版本的基因組組合，Geneious不包含任何全基因組序列的內(nèi)置拷貝。可以使用NCBI直接從NCBI下載基因組位于Geneious的Sources面板底部的文件夾（這是Geneious左側(cè)的面板）。常用研究的基因組（例如，人類(lèi)，斑馬魚(yú)和大鼠基因組）可以從NCBI中下載，使用Geniouss文件夾中的Geneomes文件夾中的鏈接。基因組也可以從其他來(lái)源下載并使用通用文件格式導(dǎo)入Geneious。

在本教程中，已經(jīng)為您創(chuàng)建了脫靶序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。由于本教程確定了釀酒酵母?LYP1基因中的CRISPR位點(diǎn)，我們對(duì)釀酒酵母基因組中的脫靶結(jié)合感興趣?。釀酒酵母的完整基因組已從NCBI下載并置于酵母基因組文件夾中。要查看這些序列，請(qǐng)打開(kāi)此文件夾。

要運(yùn)行Find CRISPR位點(diǎn)工具來(lái)識(shí)別CRISPR位點(diǎn)并檢查脫靶綁定，請(qǐng)選擇LYP1 CDS文檔（geneious的demo數(shù)據(jù)，網(wǎng)上提供下載）并轉(zhuǎn)到克隆→查找CRISPR位點(diǎn)。

在Binding位點(diǎn)旁邊，依次選擇Anywhere。在目標(biāo)類(lèi)型“GN（19）”?旁邊的字段以及PAM Site字段中鍵入“NGG”。通過(guò)檢查目標(biāo)活動(dòng)保留分?jǐn)?shù)位點(diǎn)。

現(xiàn)在通過(guò)脫靶分析和分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)評(píng)分分?jǐn)?shù)位點(diǎn)。然后選擇包含我們想測(cè)試的序列的文件夾以進(jìn)行非目標(biāo)結(jié)合：點(diǎn)擊選擇一個(gè)文件夾并選擇“酵母基因組”文件夾。對(duì)于速度和過(guò)濾策略，請(qǐng)選擇慢速 - 對(duì)所有位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分。將最大不匹配設(shè)置保留為缺省值3，以便與脫離目標(biāo)不匹配，并允許0為indels。

注意：如果我們沒(méi)有選擇Score作為脫離目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)，但選擇在較大序列的選定子區(qū)域內(nèi)查找位點(diǎn)，Geneious將自動(dòng)測(cè)試序列的未選定區(qū)域以進(jìn)行脫靶結(jié)合。

這一次，我們希望以偏離目標(biāo)分?jǐn)?shù)為結(jié)果軌跡著色，因此請(qǐng)確保此選項(xiàng)在Color CRISPR sites by設(shè)置。對(duì)話框現(xiàn)在應(yīng)該如下圖所示。點(diǎn)擊確定運(yùn)行搜索。

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CRISPR位點(diǎn)查找工具運(yùn)行后，您將看到以下消息：

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此消息出現(xiàn)是因?yàn)槲覀冊(cè)贚YP1 CDS中搜索CRISPR位點(diǎn)的序列也存在于脫靶數(shù)據(jù)庫(kù)中，因?yàn)樗墙湍富蚪M的一部分。由于它們很可能成為本身，因此該區(qū)域內(nèi)的匹配被忽略，因?yàn)樗鼈兛赡苁窍驅(qū)稽c(diǎn)guide site本身。

與之前的練習(xí)一樣，Geneious在LYP1序列中注釋了41個(gè)“GN（20）GG”CRISPR位點(diǎn)，并將它們歸入CRISPR Sites。

序列中的每個(gè)CRISPR位點(diǎn)已根據(jù)其可能結(jié)合的脫靶位點(diǎn)數(shù)量以及脫靶位點(diǎn)與原序列的相似程度進(jìn)行評(píng)分。“非目標(biāo)分?jǐn)?shù)”是根據(jù)麻省理工學(xué)院張峰實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的方法計(jì)算出來(lái)的（欲了解更多信息，請(qǐng)點(diǎn)擊這里）。根據(jù)每個(gè)脫離目標(biāo)位點(diǎn)與原始CRISPR位點(diǎn)的相似程度以及發(fā)生何種不匹配（PAM位點(diǎn)附近的不匹配將比距離PAM位點(diǎn)更遠(yuǎn)的不匹配更多地影響綁定）給出評(píng)分。脫靶位點(diǎn)的較高分?jǐn)?shù)表明與原始CRISPR位點(diǎn)更高的相似性（并且因此CRISPR / Cas復(fù)合物與脫靶標(biāo)結(jié)合的可能性更高）。CRISPR位點(diǎn)的總分是100％減去目標(biāo)基因組中偏離分?jǐn)?shù)的加權(quán)總和。因此，更高的分?jǐn)?shù)表示更好的CRISPR位點(diǎn)，而潛在的異地目標(biāo)很少或很弱。

序列中的CRISPR注釋現(xiàn)在根據(jù)其CRISPR分?jǐn)?shù)進(jìn)行著色。此配色方案使用紅色到綠色的漸變色，CRISPR分?jǐn)?shù)為20％時(shí)注釋為純紅色，85％為純黃色，100％時(shí)為純綠色。

單擊保存按鈕將注釋軌道保存在序列中。

打開(kāi)注解選項(xiàng)卡。要僅顯示注釋表中的CRISPR注釋?zhuān)?qǐng)單擊“?類(lèi)型”并選擇“?CRISPR”。單擊列并勾選脫離目標(biāo)分?jǐn)?shù)和＃脫離目標(biāo)位點(diǎn)（這些可能已被選中）。這些列現(xiàn)在應(yīng)該在注釋表中可見(jiàn)。

單擊注釋表中列的名稱(chēng)將按該列中的值對(duì)表中的行進(jìn)行排序。列名旁邊將出現(xiàn)一個(gè)小三角形，指示行是從最小值到最大值進(jìn)行排序，反之亦然。再次單擊列名將顛倒行排序的方向。按照最低到最高的脫靶評(píng)分對(duì)注釋表的行進(jìn)行排序。

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從這張表中你可以看到許多CRISPR位點(diǎn)的偏離目標(biāo)得分為100％，這意味著它們沒(méi)有脫離匹配的匹配符合無(wú)插入的條件和3個(gè)或更少的與gRNA錯(cuò)配（但是它們可能有額外的3個(gè)以上不匹配的脫靶點(diǎn)）。CRISPR guide 41具有最低的脫靶評(píng)分。在表格中選擇此行并返回序列視圖。現(xiàn)在應(yīng)該在序列視圖中選擇“CRISPR guide 41”注釋。將鼠標(biāo)懸停在注釋上，出現(xiàn)一個(gè)黃色的工具提示。此工具提示包含有關(guān)此CRISPR位點(diǎn)的更多信息。

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該位點(diǎn)的CRISPR得分為83.33％。釀酒酵母基因組中只有一個(gè)此脫序結(jié)合位點(diǎn)，但它與CRISPR guide完全匹配，所以脫靶評(píng)分為100％。該位點(diǎn)位于136,903位的ALP1 CDS→14號(hào)染色體的136,925位。

對(duì)于具有多個(gè)脫離目標(biāo)位點(diǎn)的CRISPR guide，只有前五位將列在工具提示中。此信息也可以從“?注釋”選項(xiàng)卡查看，排序和導(dǎo)出。

要從序列中刪除這些注釋?zhuān)?qǐng)單擊序列視圖中條目名稱(chēng)左側(cè)的箭頭，然后選擇刪除條目并單擊保存按鈕。

未完，繼續(xù)[4]