使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位點(diǎn)與脫靶結(jié)合位點(diǎn)[4]

練習(xí)3：查找CRISPR位點(diǎn)并檢查脫靶匹配

在之前的練習(xí)中，您對(duì)LYP1基因上的所有“GN（20）GG”位點(diǎn)進(jìn)行了與啤酒糖酵母基因組的脫靶結(jié)合的評(píng)分?。由于釀酒酵母基因組相對(duì)較小并且LYP1基因上僅有少量“GN（20）GG”位點(diǎn)，因此該搜索相對(duì)較快。但是，如果您正在測(cè)試針對(duì)較大基因組（例如，人類基因組）的脫靶結(jié)合和/或?qū)^大數(shù)量的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，則此搜索可能需要很長(zhǎng)時(shí)間。在本練習(xí)中，我們將使用Find CRISPR位點(diǎn)工具中的其中一種替代搜索策略來丟棄一些網(wǎng)站并加快搜索速度。

選擇LYP1 CDS文檔（geneious的demo數(shù)據(jù)，可以下載）并轉(zhuǎn)到克隆→查找CRISPR位點(diǎn)。

如前面的練習(xí)中，在Binding位點(diǎn)旁邊依次選擇Anywhere。在目標(biāo)類型“GN（19）”?旁邊的字段以及PAM Site字段中鍵入“NGG”。

在本練習(xí)中，我們希望使用其中一種替代搜索策略來丟棄具有強(qiáng)大異地匹配的CRISPR位點(diǎn)，因此在“?速度和過濾器”策略下選擇“?快速” - 丟棄更多位點(diǎn)。脫靶數(shù)據(jù)庫(kù)仍應(yīng)設(shè)置為酵母基因組文件夾。

對(duì)話框現(xiàn)在應(yīng)該如下圖所示。點(diǎn)擊確定運(yùn)行搜索。

使用這種搜索策略，Geneious僅在該序列中注釋了五個(gè)CRISPR位點(diǎn)。

在搜索結(jié)果中，任何發(fā)現(xiàn)與PAM位點(diǎn)中沒有不匹配或在PAM位點(diǎn)旁邊的前8bp內(nèi)發(fā)現(xiàn)有脫靶匹配的位點(diǎn)都將從搜索中刪除。Geneious沒有為這些位點(diǎn)尋找進(jìn)一步的非目標(biāo)匹配，CRISPR位點(diǎn)也沒有在序列中注釋。

要從序列中刪除這些注釋，請(qǐng)單擊序列視圖中條目名稱左側(cè)的箭頭，然后選擇刪除條目。

未完，繼續(xù)[5]